Направи дарение на училище!

Автори: Силвия Волева (II МБАЛ – София ЕАД), Емилия Николова (Катедра “Медицинска химия и биохимия”, МФ, Медицински Университет – София)

Абстракт

Острото респираторно заболяване, наречено COVID-19, причинено от коронавирус (SARS-CoV-2), което се появи в Китай в края на 2019 г., продължава да се разпространява бързо, доведе до значителна заболеваемост и смъртност на населението по света. Глобалното разпространение, бързата трансмисия и честата поява на нови варианти на вируса доведе до голяма заплаха за обществено здраве и сериозно претоварване на здравните системи. Понастоящем основният и най-чувствителен метод препоръчван от СЗО за потвърждаване на инфекция с COVID-19 е полимеразно- верижната реакция с обратна транскрипция (RT-PCR). Същевременно пандемията  от COVID-19 се разпространява повече от две години, претоварвайки ограничените клинични ресурси,  което предизвиква затруднение в  тестването на пациенти, струпването на големи опашки от потенциално заразени лица, които чакат да бъдат тествани, като същевременно осигуряват поле за размножаване за болестта. Нуждата от прилагането на бърз, лесен и едновременно високо-чувствителен метод за детекция на SARS-CoV-2 доведе до голям научен интерес към т.нар. LAMP метод (Loop-mediated Isothermal Amplification). В настоящия обзор описваме същността на този бърз, силно чувствителен, молекулен тест, който би могъл да се използва в т.нар. point-of-care (на мястото, където има нужда) като в приемните отделения на  клиниките, малки медицински центрове, в ДКЦ, офисите, летища. Този тест може  да бъде извършен от минимално обучени лица, с минимално оборудване.

Разбери повече за БГ Наука:

***

Ключови думи: коронавирус, диагностика, LAMP метод

Въведение

Коронавирусите са голямо семейство от РНК-ови вируси, заразяващи различни животни и хора. При хората могат да причинят леки до тежки респираторни инфекции, такива вируси са HCoV-229E, OC43, NL63 и HKU1(1, 2). През 2002 г. и 2012 г. съответно, два високопатогенни коронавируса със зоонозен произход, а именно коронавирус с тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV) и коронавирус с респираторен синдром на Близкия изток (MERS-CoV), се проявиха при хората и причиниха фатални респираторни заболявания, превръщайки вируса в нов проблем за общественото здраве през двадесет и първи век (3).  В края на 2019 г. нов коронавирус, обозначен като SARS-CoV-2, се появи в град Ухан, Китай, и предизвика огнище на необичайна вирусна пневмония.  Типичните симптоми на т.нар. коронавирусна болест 2019 (COVID-19), са  кашлицата, температура,  болки в гърлото, главоболие, хремата, както и загубата на обоняние и вкус. Тъй като е силно трансмисивна, тази нова инфекциозна вълна, се разпространи бързо по целия свят (4, 5). Тя надмина SARS–CoV и MERS-CoV, както по отношение на броя на заразените хора, така и по отношение на пространствения обхват на епидемичните зони, превръщайки се в пандемия. SARS-CoV-2 и различните му нововъзникващи варианти, представлява сериозна заплаха за живота и  здравето на хората  с  продължаващите си пандемични вълни с над 5,9 милиона смъртни случая и 435 милиона потвърдени случаи, съобщени в целия свят към последната седмица на февруари 2022 г., като напоследък отново беше наблюдавано бързо увеличение на случаи на глобално ниво (6-8).  След алфа, бета, гама и делта вариантите на SARS-CoV-2, най-новият вариант B.1.1.529 (наречен Omicron) е класифициран от СЗО на 26 ноември 2021 г. от вариант VUM (вариант под наблюдение), като VOC (вариант, будещ безпокойство) и създава тревожни ситуации в световен мащаб. Всичко това показва, че от първостепенно значение за общественото здравеопазване е налагането  на устойчива стратегия за анализ на пациенти със съмнение за SARS-CoV-2 и неговите варианти, базирани на бързи, надеждни и достъпни диагностични тестове. Това, както и мерките като носенето на маски, честото миене на ръце и социалното дистанциране може да бъде достатъчно за предотвратяване и ограничаване на големи огнища, докато са в ход програмите за ваксинация срещу COVID-19.

Златен стандарт за тестването на  COVID-19 е RT-PCR (полимеразно-верижна реакция с обратна транскрипция), който открива генетичния материал  на SARS-CoV-2 в проби от назофаринкса, алвеоларна течност, храчка и др. Въпреки, че е с най-висока специфичност и чувствителност, тази диагностика е сложна, трудоемка, скъпа, изисква квалифициран персонал и специално оборудвани помещения, което затруднява масовото й прилагане. В тази връзка, широкото използване на RT-PCR диагностиката в началото на пандемията доведе до недостиг на необходимите за доказване на коронавирусната РНК реактиви и реагенти, в световен мащаб. Усилията на много научни групи по света са насочени към разработването и оптимизирането на по-бързи и лесно приложими генетични тестове, като например базирани на LAMP метода, при който може да получим резултат за около половин час. 

LAMP е метод за амплификация на нуклеинови киселини- ДНК или РНК, който позволява бързо и чувствително откриване на специфичен ген (9,10). LAMP, обединен с обратна транскрипция (RT-LAMP), е бил успешно използван за откриване на няколко респираторни РНКови вируси (11-13) включително SARS-CoV-2 (14).  RT-LAMP е добра алтернатива на RT-PCR поради своята висока специфичност и чувствителност, но по-малко време за изпълнение (обикновено 30 минути). В RT-LAMP амплификацията на генетичния материал на вируса се извършва при постоянна температура и следователно диагностичните тестове, базирани на RT-LAMP, могат да се извършват на места с минимални ресурси, тъй като изискват минимално оборудване (термостат или водна баня настроени на константна температура). 

Резултатите могат да се отчитат визуално – т.нар. колориметрично отчитане. Това става с промяна на цвета на специфичното багрило, базирано на промяна на рН (фиг.1).

Фигура 1. Визуална детекция с рН-чувствително багрило – фенол ред.  В процес на реакцията се натрупват продукти, като пирофосфат и протони, които се освобождават по време на ДНК полимеризацията, след включването на дезоксинуклеотид трифосфати. Промените в цвета при използване на Фенол ред – червено (негативна контрола) и жълто (позитивен резултат и контрола).

Друг визуален метод за LAMP детекция, използва мътността, предизвикана от натрупването на магнезиев пирофосфат. Възможно е използването на ДНК-интеркалиращи багрила, включени в реакцията, които могат да се видят в реално време. Простите технически и инструментални изисквания на визуалните RT-LAMP тестове ги правят изключително атрактивни за използване и изпълнение на място в условия на нисък ресурс, като масов скринингов тест.

При наличие на оборудване или за проверка специфичността и чувствителността на метода, продуктите на реакцията могат да бъдат анализирани с помощта на ДНК-интеркалиращи багрила и електрофореза в агарозен гел с UV визуализация или флуоресценция в реално време.

Принцип на LAMP анализа за откриване на нуклеинови киселини

LAMP се използва предимно за диагностика и откриване на заболявания. Амплификацията и откриването на нуклеиновата киселина могат да бъдат извършени едновременно, в една стъпка, чрез инкубиране на пробата от нуклеинова киселина със обратна транскриптаза, специално проектирани праймери и Bst ДНК полимераза. Амплификацията протича при около 60 до 65 °C, в зависимост от оптималната температура на LAMP (15). За LAMP анализа, наборът от праймери се състои от вътрешни и външни праймери, които разпознават различни области на целевата ДНК последователност (фиг 2).

Фигура 2. LAMP амплификация. Правият вътрешен праймер (FIP) се състои от F2 и F1c, като последната е комплементарна последователност на F1 последователността, докато обратният вътрешен праймер (BIP) се състои от B2 и B1c – комплементарна последователност на B1. Правият външен праймер (F3) и обратният външен праймер (B3) имат последователностите, които са комплементарни съответно на последователностите на F3c и B3c от двете вериги на ДНК. F3 и B3 обграждат желаната таргетна последователност, която ще се амплифицира.

Процесът на амплификация на LAMP започва със свързването на FIP с целевата ДНК в нейната F2 област, за да образува двойноверижна ДНК, при около 65 °C (16). ДНК полимеразата с активност на изместване на веригата след това инициира синтеза на ДНК от FIP, като едновременно измества единична верига от ДНК, ако има такава. След тази стъпка на иницииране, F3 праймерът се свързва със своя комплементарен F3c регион и измества FIP-комплементарната верига. Поради последователността на F1c в FIP, веригата FIP е в състояние да образува примковидна структура в единия край на ДНК. Тази верига след това служи като таргетна за BIP-иницииран ДНК синтез и последващо изместване на веригата от B3-праймирана ДНК синтеза. Така единичната ДНК верига да образува две примковидни структури, което води до структура на ДНК, подобна на гира. Тази ДНК служи като шаблон за последваща синтеза. След образуването на гиро-подобната структура, ДНК полимеразата започва синтеза на ДНК в F1 региона. FIP също така хибридизира със структурата с една бримка от F2 региона и ДНК синтезът на този праймер причинява изместване на F1-праймираната верига и самосвързване в бримкова структура. Накрая, от B1 региона в новия цикъл, отново започва ДНК синтез, като текущата матрица се удължава, а същевременно се създава и  нова от изместването на FIP – комплементарната верига. От този повтарящ се процес се постигат дълги конгломерати от ДНК, която може да бъде амплифицирана до 109 пъти в рамките на един час (16).

За подобряване на ефективността на амплификация е разработен LAMP метод с допълнителни примкови праймери – loop primer – LF/LB. При него се използват шест праймера вместо четири, като правият и обратният праймерите (LF и LB) са съответно между регионите F1/F2 и B1/B2 (16). Доказано е, че LF и LB праймерите подобряват процеса на LAMP, тъй като амплификацията се усилва от увеличените начални точки за синтез на ДНК (17). Поредица от изисквания трябва да бъдат спазени при дизайна на специфичните праймери и последващото им оптимизиране за успешен LAMP анализ (16).

Оригиналният LAMP протокол се модифицира, с цел разработване на LAMP с обратна транскрипция (RT-LAMP) и мултиплекс LAMP. С RT-LAMP се откриват РНК последователности вместо ДНК. Ензим – обратна транскриптаза се добавя към LAMP реакционната смес, за да се осъществи транскрипцията на РНК в комплементарна ДНК (кДНК), която ще се използва за амплификация. LAMP с обратна транскрипция (RT-LAMP) се прилага за откриване на различни РНК вируси, включително вируси на Ебола, Зика, Западен Нил, грип и жълта треска, а сега и за SARS-CoV-2. Разработени са мултиплексни LAMP анализи, с използването на повече праймери или с уникални флуоресцентни сигнали за да се открият множество патогени в една и съща проба (18). Всички тези модификации на LAMP показват колко обещаваща е тази методика в областта на инфекциозната диагностика. 

Дискусия

За да бъде ограничена пандемията, освен ваксинацията и терапията, ранната диагностика на вируса е едно от условията за намаляване на трансмисията. Това налага разработването на нови по-бързи, евтини и лесни за употреба диагностични методи. RT- LAMP е високо чувствителна, специфична и иновативна молекулярна техника, която би могла да бъде добра алтернатива на RT- PCR анализа, в места, които нямат достъп до специализирани лаборатории, включително в домашни условия. В момента различни научни групи разработват RT-LAMP техники за бързо и точно диагностициране на SARS-CoV-2, с цел справяне с пандемията. Основното предимство е бързината на анализа, тъй като издаването на резултатите, използвайки RT-LAMP е в пъти по-бързо от това на RT-PCR (16). Друго предимство е цялостната лекота на изпълнение, тъй като изотермичната характеристика на теста гарантира, че може да се използва достъпно и евтино оборудване. RT-LAMP методът показва висока ефективност при значително по-къс времеви интервал в сравнение с конвенционалния RT-PCR (17).

Вече има редица проучвания по отношение специфичността и чувствителността на RT-LAMP анализът за доказване на SARS-CoV-2. По-голямата част от проучванията, които използват екстрахирана вирусна РНК за диагностика, съобщават за поне 90% чувствителност и специфичност, над една трета от тези проучвания съобщават за 100% чувствителност и специфичност. Чувствителността като цяло е по-ниска за проучвания, които използват първични проби от пациенти за диагностика, докато специфичността не се повлиява.

Според съществуващата литература, LoD (граница на откриване) на теста е достатъчен за идентифициране на индивиди с вирусни титри, достатъчно високи, за да предадат вируса (300–1000 вирусни копия на μL) (19,20). Тази чувствителност на теста се счита за достатъчна за наблюдение и скрининг на асимптоматичната популация. Следователно наличието на такова решение за тестване е от голямо значение, тъй като пиковете на инфекциозността настъпват преди или при появата на симптомите (21). Бързата еволюция на COVID-19 отчасти се дължи на асимптоматичните индивиди, които предават вируса, затова усилията са насочени към стратегия за прилагане на надеждни тестове, масово приложими в обществото. Този метод на диагностика би бил особено приложим в страните с ограничен финансов ресурс, както и на места като летища и дори в домашни условия.

Няколко автори наскоро показаха, че използването на различни двойки праймери, таргетиращи различни вирусни гени, повишава чувствителността на RT-LAMP. Също така са докладвани различни протоколи за откриването на SARS-CoV-2 в проби от слюнка, като минимално инвазивен материал и приложим за масов скрининг в училищата (22-25).

И накрая, отчитането на резултатите е сравнително лесно, тъй като може да се използва мътност, или pH – базирано багрило и  да се наблюдава  с невъоръжено око. Бързината, широката приложимост и рентабилността на процедурата показват високия диагностичен потенциал за скрининг на SARS-CoV-2 вируса. За сравнение, масово използваните бързи тестове, които откриват вирусни протеини (т.нар. антигени тестове) са със значително по-малка чувствителност и понякога специфичност спрямо RT-LAMP анализа. Поради гореспоменатите предимства, RT-LAMP може да се имплементира като рутинен тест в местата от първа необходимост (point-of-care), изпълняващ ключова роля за проследяване разпространението на вируса.

Като се има предвид необходимостта от увеличаване на капацитета за скрининг за ограничаване на пандемията от COVID-19, RT-LAMP анализът, предлага нов път в молекулярната диагностика. Такава концепция за point-of-care молекулярна диагностика е подходяща и за откриване на всяко друго инфекциозно заболяване, чрез използване на съответния комплект LAMP праймери. Следователно, той може да играе важна роля в борбата с огнища на пандемии, както днес така и в бъдеще. Все още масовият скрининг е възпрепятстван поради липса на обучен персонал и широко достъпно специализирано оборудване. Надяваме се, че този вид молекулярна диагностика ще осигури достъпни тестове в близко бъдеще и не само ще увеличи капацитета за откриване, но и значително ще намали разходите, свързани с диагнозата и последващото лечение, като по този начин ще помогне в борбата срещу коронавируса и би могла да изиграе важна роля в борбата с огнища на бъдещи епидемии и пандемии.

References:

1. Gaunt ER, Hardie A, Claas EC, Simmonds P, Templeton KE. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229e, hku1, nl63, and oc43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time pcr method. J Clin Microbiol. 2010;48:2940-7.
2. Zeng ZQ, Chen DH, Tan WP, Qiu SY, Xu D, Liang HX, et al. Epidemiology and clinical characteristics of human coronaviruses oc43, 229e, nl63, and hku1: A study of hospitalized children with acute respiratory tract infection in guangzhou, china. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018;37:363-9.
3. Cui J, Li F, Shi ZL. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 2019;17:181–192. doi: 10.1038/s41579-018-0118-9.
4. Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet. 2020;395:689–697. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30260-9. 
5. Hui DS, et al. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health – the latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China. Intl. J. Infect. Dis. 2020;91:264–266. doi: 10.1016/j.ijid.2020.01.009. 
6. Dhama K, Khan S, Tiwari R, et al. Coronavirus disease 2019-COVID-19. Clin Microbiol Rev. 2020;33(4):e00028-20. doi:10.1128/CMR.00028-20
7. Mohapatra RK, Perekhoda L, Azam M, et al. Computational investigations of three maindrugs and their comparison with synthesized compounds as potentinhibitors of SARS-CoV-2 main protease (Mpro): DFT, QSAR, moleculardocking, and in silico toxicity analysis. J King Saud Univ Sci. 2021;33:101315.
8. WHO. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. WHO COVID-19 Dashboard—Up to date data on pandemic; Accessed January 2022. https://www.who.int/publications/m/item/weekly-epidemiological-update-on-covid-19–11-january-2022
9. Nagamine, K., Hase, T., & Notomi, T. J. M. C. P. (2002). Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and cellular probes, 16(3), 223-229.
10. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., & Hase, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research, 28(12), e63-e63.
11. Ahn, S. J., Baek, Y. H., Lloren, K. K. S., Choi, W. S., Jeong, J. H., Antigua, K. J. C., & Song, M. S. (2019). Rapid and simple colorimetric detection of multiple influenza viruses infecting humans using a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic platform. BMC infectious diseases, 19(1), 1-12.
12. Bhadra, S., Jiang, Y. S., Kumar, M. R., Johnson, R. F., Hensley, L. E., & Ellington, A. D. (2015). Real-time sequence-validated loop-mediated isothermal amplification assays for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). PloS one, 10(4), e0123126.
13. Thai, H. T. C., Le, M. Q., Vuong, C. D., Parida, M., Minekawa, H., Notomi, T., & Morita, K. (2004). Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical microbiology, 42(5), 1956-1961.
14. Thompson, Dorian, and Yu Lei. „Mini review: Recent progress in RT-LAMP enabled COVID-19 detection.“ Sensors and Actuators Reports 2.1 (2020): 100017.
15. L.E. Lamb, S.N. Bartolone, E. Ward, M.B. Chancellor.Rapid detection of novel coronavirus (COVID19) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification.SSRN Electron. J. (2020) 
16. M.M. Parida, S. Sannarangaiah, P.K. Dash, P.V.L. Rao, K. Morita.Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.Rev. Med. Virol. (2008)
17. P.R. Sahoo, K. Sethy, S. Mohapatra, D. Panda.Loop mediated isothermal amplification: an innovative gene amplification technique for animal diseases.Vet. World, 9 (2016), pp. 465-469
18. P.C. Foo, Y.Y. Chan, M. Mohamed, W.K. Wong, A.B. Nurul Najian, B.H. Lim. Development of a thermostabilised triplex LAMP assay with dry-reagent four target lateral flow dipstick for detection of Entamoeba histolytica and non-pathogenic Entamoeba spp.Anal. Chim. Acta. (2017)
19. Wyllie, Anne L., et al. „Saliva or nasopharyngeal swab specimens for detection of SARS-CoV-2.“ New England Journal of Medicine 383.13 (2020): 1283-1286.
20. Lescure, F. X., Bouadma, L., Nguyen, D., Parisey, M., Wicky, P. H., Behillil, S., & Yazdanpanah, Y. (2020). Clinical and virological data of the first cases of COVID-19 in Europe: a case series. The Lancet Infectious Diseases, 20(6), 697-706.
21. He, X., Lau, E. H., Wu, P., Deng, X., Wang, J., Hao, X., & Leung, G. M. (2020). Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nature medicine, 26(5), 672-675.
22. Anahtar, M. N., McGrath, G. E., Rabe, B. A., Tanner, N. A., White, B. A., Lennerz, J. K.,& Rosenberg, E. S. (2021, February). Clinical assessment and validation of a rapid and sensitive SARS-CoV-2 test using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification without the need for RNA extraction. In Open Forum Infectious Diseases (Vol. 8, No. 2, p. ofaa631). US: Oxford University Press.
23. Kellner, M. J., Ross, J. J., Schnabl, J., Dekens, M. P., Heinen, R., Grishkovskaya, I., & Vienna Covid-19 Diagnostics Initiative. (2020). A rapid, highly sensitive and open-access SARS-CoV-2 detection assay for laboratory and home testing.
24. Yang, Q., Meyerson, N. R., Clark, S. K., Paige, C. L., Fattor, W. T., Gilchrist, A. R.,& Sawyer, S. L. (2020). Saliva twostep: an RT-LAMP saliva test for SARS-CoV-2 and its assessment in a large population. medRxiv, 2020-07.
25. Dudley, D. M., Newman, C. M., Weiler, A. M., Ramuta, M. D., Shortreed, C. G., Heffron, A. S., & O’Connor, D. H. (2020). Optimizing direct RT-LAMP to detect transmissible SARS-CoV-2 from primary nasopharyngeal swab samples. PLoS One,15(12), e0244882.

Адрес за кореспонденция: nikolova.emily@gmail.com

Вземете (Доживотен) абонамент и Подарете един на училище по избор!