Направи дарение на училище!

Автор: Калина Данова

 Вторични метаболити от растителен произход

Според Световната здравна организация, около 80% от населението на планетата все още разчита основно на лекарствените растения като традиционен метод на лечение. Също така, до този момент около 25% от предписваните лекарствени продукти в индустриализираните държави са от растителен произход и този процент достига до 50%  отпускащите се без рецепта. Около 52% от противовъзпалителните и 51% от противотуморните средства също са от растителен произход.

Днес много от фармакологично активните природни съединения от растителен произход вече се произвеждат синтетично в широк мащаб (например кофеин, теофилин, теобромин, ефедрин, псевдоефедрин, еметин, папаверин, L-допа, салицилова киселина). Въпреки това, все още са многобройни и примерите за лекарствени молекули, чийто синтез е прекалено сложен или скъпоструващ и те все още се добиват в промишлен мащаб чрез извличане от растителен материал: стероиди – хормони (диосгенин, хекогенин, стигмастерол), дигиталисовиглюкозиди (дигоксин, дигитоксин), алкалоиди– тропанови (атропин, хиосциамин, скополамин), резерпин, катарантус алкалоиди (винкристин, винбластин), физостигмин, пилокарпин, хининови алкалоиди (хинин, хинидин), колхицин, кокаин, тубокурарин. Огромен е и броят на молекулите, служещи като “матрица” за лекарствен дизайн и полу-синтез на нови лекарствени молекули. Така например, тропановите алкалоиди, физостигминът, хининът, кокаинът, кодеинът и морфинът, салициловата киселина служат като модел за дизайн и синтез на молекулите на различни антихолинергици, антихолинестеразни, антималарийни препарати, на локалните анестетицибензокаин, прокаин, лидокаин, на аспирина.

Широкият добив на биологично активни вещества от растителни източници е свързан с редица недостатъци. Безконтролният добив от естествените находища на диворастящите видове може да доведе до тяхното застрашаване или пълно унищожение. А съдържанието на активната съставка обикновено широко варира в зависимост от условията в местообитанието на растението. Култивирането на някои видове в полеви условия, извън естествените им местообитания, понякога също може да доведе до намаляването на съдържанието на търсените вещества. Това е така, защото вторичните метаболити са свързани с оцеляването на растителния вид в неговата естествена среда и се синтезират като отговор на факторите на именно тази среда.

Разбери повече за БГ Наука:

***

Големият процент на използваните в момента лекарствени препарати от растителен произход, както и засилващият се изследователски интерес за търсене на нови терапевтични молекули на базата на хемотаксономията, етнофармакологията и фармакотаксономията налагат търсенето на алтернативни подходи за добив на биологично активни вещества от растителен произход.

Приложимост на растителната биотехнология като допълнение и алтернатива на конвенционалните методи за растително култивиране

Растителната биотехнология се основава на възможността да се култивират отделни клетки, тъкани, органи или цяло растение в хранителна среда при стерилни условия извън естествената среда. Тази техника е възможна поради свойството “тотипотентност” на растителната клетка и способността й да регенерира до цял организъм.

Растителните клетъчни и тъканни култури са перспективно допълнение както при получаването на голямо количество посадъчен материал за кратко време, така и за добив на биологично активни вещества при стандартизирани условия.

Предимствата и възможните приложения на растителната биотехнология биха могли да се обобщят по следния начин:

• Микроразмножаване и връщане в природата на редки, ценни или застрашени видове. Методът дава възможност за вегетативното възпроизвеждане на растения, при които не се залагат семена или тяхното покълване е затруднено или забавено;
• Поради асептичния метод на работа, полученият посадъчен материал е свободен от патогени, което дава възможност за бързото възпроизвеждане на големи количества чист посадъчен материал;
• Избягват се ограниченията върху масовата продукция на посадъчен материал, произлизащи от инвазията на болести и неприятели по растенията, както и на неблагоприятните условия от страна на околната среда;
• Съществува постоянен достъп до култивирания растителен материал, независимо от промените в икономическите, климатични и географски условия, характерни за естествените местообитания на видовете. Изключват се и загубите, причинени от унищожаването на насажденията от патогени или тревопасни животни;
• Стандартизирането на условията на производство води до стандартизиране на съдържанието на активните съставки, а добивът на по-специалните категории вещества, като например токсични/наркотични такива, се извършва при строго контролирани условия. Също така, добивът на ценни вторични метаболити от редки или застрашени видове се осъществява в лабораторни условия, без да се нарушават техните естествени находища;
• Производството чрез биотехнологични методи е гъвкаво и много лесно се адаптира към промените на пазара;
• Контролираната система за добив ин витро би могла да бъде източник на нови природни съединения;
• Растителната ин витро система е източник за изолирането на широк набор от ензими, необходими при провеждането на специфични позиционно- и стереоспецифични реакции, трудни за извършване в химични условия;
• Растителните клетъчни култури са безценен модел за изясняване на биосинтетичните пътища на вторичните метаболити. Те предоставят целогодишно свеж растителен материал, еднакъв по качество и почти в неограничени количества. Освен това, метаболитната активност при тези условия е висока и за няколко седмици се постига биосинтез на вторични метаболити, който при природни условия би изисквал месеци.

Основни принципи на растителната биотехнология

Ин витро култивирането на растителен материал се състои в отглеждането на жива растителна тъкан при постоянни условия на външната среда и състав на хранителната среда, в която културата се развива. Растежът и развитието ин витро са в комплексна зависимост от редица фактори като:

– Генотипно обусловените дадености на растението. Важно е дали растението е едно- или двусемеделно, дали е голосеменно или покритосеменно, дали е тревисто или дървесно, дали залага или не семена и др. При култивирането на лечебни растения за тяхната податливост към ин витро манипулации голямо значение имат и количествата продуцирани вторични метаболити.

– Фактори на хранителната среда. Водното съдържание, макро- и микроелементния състав са жизненоважни за растителния организъм ин витро, също толкова, колкото и ин виво. Водата съставлява около 95% от хранителната среда и поради тази причина нейното качество е от особено значение. Ето защо за целите на растителната биотехнология се използва дестилирана вода, а при култивирането на протопласти, клетки и меристемна тъкан – бидестилирана. Като желираща съставка на твърдите хранителни среди най-често се използва агар. Той представлява линеен полигалактозид, добиван от червени водорасли, най-често от родовете Gelidiumи Gracilaria. Концентрацията му варира в зависимост от целите на работата и от неговото качество (0.6-0.8%). Концентрацията му оказва влияние върху наличността и степента на усвояване от растителния експлант на добавените в средата хранителни компоненти. Добавянето на захари в хранителната среда е необходимо поради по-слабо ефективната, а често и отсъстваща способност за извършване на фотосинтеза и въглеродна фиксация при ин витро култивираното растение.

– Основните макроелементи, задължително присъстващи в хранителната среда, най-често са азот, фосфор, калий, калций, магнезий, сяра.

– Микроелементите, които се прибавят, са желязо, цинк, бор, манган, мед, кобалт, никел, алуминий, молибден, йод.

– Растежните регулатори са жизненоважни ендогенни фактори на растежа и развитието на растителния организъм. Доскоро се е считало, че растежните регулатори са едва 5 групи (ауксини, гиберелини, цитокинини, етилен, абсцисиева киселина). С напредването на изследванията се установява и съществуването на растителни стероидни хормони (брасиностероиди), регулиращиредица процеси на диференциация в растителния организъм. Ред други сигнални молекули също така имат отношение към устойчивостта спрямо патогени и тревопасни животни, например жасмонена и салицилова киселина. Добавяните в средата растежни регулатори имат ключова роля за насочването и поддържането на степента на де-диференциация, стимулирането на микроразмножаването и последващото вкореняване, както и повлияването на биосинтеза на вторичните метаболити ин витро.

– Към средата се добавят и други органични вещества, например аминокиселини (глицин) и полиолътинозитол.

– Киселинността на средата (рН)е важен фактор за правилното протичане на физиологичните процеси в растението. Обикновено стойността й варира между 5.5 и 6.

– Фактори на условията на култивиране (стерилност, светлина, температура) Стерилността е основен принцип при ин витро култивирането. Това се дължи на добавяните в състава на хранителната среда широк набор от компоненти, които освен растежа и развитието на растенията са предпоставка и за оптималното развитие на микроорганизми от различен тип – бактерии, гъби, плесени. Поради тази причина растителната биотехнология е метод за асептичното култивиране на растителен материал, което се осигурява от стерилизацията на хранителните среди, съдовете и инструментите, с които се работи, и извършването на всички манипулации по културите в стерилна среда. Тези условия се осигуряват най-често чрез автоклавиране при 121°C (1 atm) на материалите и средите и работа под стерилен поток от въздух, в специално конструирани ламинарни боксове. Термолабилните компоненти на средата се добавят чрез филтруване през стерилен филтър с размер на порите 0.45µm. За отглеждането на клетъчните, тъканни и органови култури е необходимо да се осигурят специално оборудвани за целта култивационни помещения. В тях се контролират условията на външната среда, обхващащи: температурен режим (най-често се поддържат 24-26°C); светлинен режим (осигурява се от луминесцентно осветление като неговите спектрална характеристика, интензитет и фотопериод се подбират в зависимост от видовата специфичност на конкретното растение и типа култура, който се отглежда).

– Факторите като влажност, съдържание на кислород и въглероден диоксид зависят от микроклимата вътре в самите култивационни съдове, които се използват (свързани с техния обем и форма, както и диаметъра и начина на тяхното затваряне). Важно е да се отбележи също, че разтвореният в течна хранителна среда кислород е по-достъпен за растението, отколкото в твърдата агарова среда.

Примери за търговска реализация на фундаменталните изследвания при добива на биологично активни вещества от растителен произход

За разлика от широкото приложение и пазарна реализация на растителната биотехнология в селското стопанство и цветопроизводството, реализация за добива на вторични метаболити в практиката е все още ограничена. Въпреки това, редица успешни примери дават основание да се възлагат надежди за бъдещото развитие на това направление. Досега има регистрирани около 28 000 патента в областта на добива на биологично активни вещества по методите на растителната биотехнология. Част от тези разработки намират реално приложение при:

• промишленото производство на гинзенозиди(биологичноактивните вещества, добивани от жен-шен) от NittoDenkoCorporation, Япония от 1985 година до днес. Добиваната субстанция се влага в производството на различни напитки от компанията. Комерсиализацията на ин витро продуцираната биомаса е добър пример за прилагане на методите на растителната биотехнология за реализация на природния потенциал на дивия генотип като се избегнат неблагоприятните условия на околната среда и прилагането на хербициди. Производството се осъществява без прилагане на генното инженерство.
• продукцията на берберин от коренови култури на Coptisjaponicaи Thalictrumminus от японската корпорация MitsuiPetrochemical Industries. Първоначално продукцията на берберин от клетъчни култури на japonicaе разработена от Furuya и сътр., KitasatoUniversity (1972) и Yamamoto&ShoyakugakuNipponPaint (1981). Впоследствие Sato&Yamada, KyotoUniversity (1984) селектират високопродуктивна линия, която се внедрява от компанията.
• продукцията на пурпурин – клетъчни култури от Rubiaakane ( Ltd.).
• продукцията на шиконин в суспензия на Lythospermumerythrorhizon ( Ltd.)
• продукцията на гинзенозоди в коренови култури от дивия генотип на Panaxginseng – CBN Biotech Co, Korea. Първоначално разработката е осъществена от изследователска група в ResearchCenterfortheDevelopmentoftheAdvancedHorticultural Technology (HortTech), Chungbuk National University с финансовата подкрепа на Министерството на науката и технологията, Инжинеринговата фондация и Службата за развитие на селското стопанство в Корея.
• продукцията на паклитаксел от клетъчни култури на Taxus от PhytonBiotech, Germany.

За постигането на промишлена продукция на растителните биологично активни вещества е необходимо процесът успешно да се мащабира от получените в лабораторни условия резултати до промишлен мащаб. След тази стъпка процесите могат да бъдат внедрени в биореактор. Стандартно, мащабирането започва в течна хранителна среда в ерленмайерова колба 250 – 300 ml при лабораторни условия, преминава през увеличаване на обема до 1 l, след което културата се адаптира към 30 – 150 – 1000 – 70 000 l биореактор.

Ин витро тъканни, клетъчни и органови култури в Института по органична химия с Център по фитохимия-БАН

Развитието на тематиката по ин витро култивиране на лечебни и ароматични растения в Института започна през 2010 година, с много ентусиазъм, помощ от колегите от лаборатория „Химия на природните съединения“ и търсене на финансиране от различни източници. Впоследствие, в рамките на двустранния проект PhytoBalk (Снимки 1-3) по програмата за българо-швейцарско сътрудничество, съфинансирана от Швейцарската национална научна фондация (Swiss National Science Foundation) и Министерство на образованието и науката, 2013 – 2016, с ръководител от българска страна д-р Калина Данова, беше извършено значително подобрение на наличното оборудване като в момента са създадени условия за гъвкаво отглеждане на различни по тип ин витро култури – както диференцирани линии от цяло стерилно растение, надземни части или конвенционални генетично-нетрансформирани корени (Снимка 4), така и недиференцирани линии (Снимка 5). Работи се както в твърда, агарова, така и в течна хранителна среда. Приведена е в експлоатация и биореакторна система RITA ® TIS (Снимка 6).

В момента се поддържа колекция от около 20 вида лечебни и ароматични растения както от българската, така и от флората на северна Европа и Средиземноморието.

Снимка 1. Работна среща по проект PhytoBalk, Веденсвил, Швейцария, март 2014, Институт по приложни изследвания, Цюрих (ZHAW -ZürcherHochschulefürAngewandteWissenschaften). Горе, от ляво надясно – доц. д-р Милка Тодорова, доц. д-р Антоанета Трендафилова и д-р Калина Данова, Институт по органична химия с Център по фитохимия-БАН, д-р Евелин Волфрам, ръководител на проекта от стана на ZHAW, доц. д-р Сашка Крумова, Институт по биофизика и биомедицинскоинженерство, БАН, проф. д-р ТобиасМерсебургер, завеждащ Департамента по биотехнология към ZHAW. Долу – д-р Калина Данова с проф. д-р Беат Майер – почетен ръководител на проекта PhytoBalk.

Фигура 2. Горе вляво – доц Трендафилова и доц. Тодорова по време на работна визита в ZHAW. Горе вдясно – с колегите Сара Брем и Самюел Петер, долу – заедно и с д-р Евелин Волфрам.

Снимка 3. В Института по органична химия с Център по фитохимия, БАН – горе отляво – доц. д-р Красимира Идакиева и доц. д-р Антоанета Трендафилова – ИОХЦФ-БАН, доц. д-р Сашка Крумова – ИБФБМИ-БАН, асистент Виктория Иванова и д-р Калина Данова – ИОХЦФ-БАН,долу отляво –проф. д-р Юлиана Марковска – Биологически факултет на СУ „Св. Климент Охридски“, доц. д-р Милка Тодорова – ИОХЦФ-БАН.

Снимка 4. Горе: отляво на дясно – цяло стерилно растение от Бял пелин (ArtemisiaalbaTurra) и Британси оман (InulabritannicaL.), култури от надземни части от Рихерова звъника (HypericumricheriVill.) и Мурсалски чай (SideritisscardicaGriseb.), долу отляво – конвенционални, генетично не-трансформирани корени от Британски оман и екстракт от надземните части на ин витро отгледана Рихерова звъника с високо съдържание на кондензирани антрахинони – хиперицин и псевдохиперицин.

Снимка 5. Вляво – регенерация на надземни части от калус на балканския ендемит Румелийска звъника (HypericumrumeliacumBoiss.), вдясно –линия от клетъчни агрегати на Бял пелин с различна степен на компактност на структурите.

Снимка 6. Биореакторна система RITA®, temporaryimmersionsystem в ИОХЦФ-БАН, вдясно – биомаса от надземни части от балканския ендемичен подвид котенце (Pulsatillamontanassp. balcana), отгледана в системата.

По охарактеризиране на химичния състав и белтъчен профил на ин витро отглежданите растения от ИОХЦФ-БАН работим с колегите доц. д-р М. Тодорова, доц. д-р А. Трендафилова, доц. д-р К. Алипиева, доц. д-р К. Идакиева, гл. ас. д-р Ю. Райнова, ас. В. Иванова.

В рамките на различни проекти се работи в тясно сътрудничество с колеги както от България –Институт по биофизика и биомедицинско инженерство-БАН (проф. Стефка Танева, доц. д-р Сашка Крумова, ас. Ния Петрова); Институт по биоразнообразие и екосистемни изследвания-БАН (доц. д-р Люба Евстатиева, гл. ас. д-р Ина Анева); Институт по биология и имунология на размножаването-БАН (доц. д-р Елена Стоянова); Ботаническа градина-БАН (доц. д-р Антоанета Петрова, гл. ас. Диана Венкова); Институт по физиология на растенията и генетика-БАН (доц. д-р Албена Иванова, проф. д-р Виолета Великова, доц. д-р Цонко Цонков); БФ на Софийски университет „Св. Климент Охридски“ (проф. д-р Юлиана Марковска), така и от чужбина –FacultyofPharmacy, University of Pisa, Italy, Marie Curie PEOPLE EMAP FP7 project (проф. д-р Луиза Пистели и сътрудници); Institute of Experimental Botany, Prague, CAS (доц. д-р Вацлав Мотика и сътрудници); Bilateral Exchange projects between the Czech Academy of Sciences and the Bulgarian Academy of Sciences; Zurich Institute of Applied Sciences (ZHAW), Department of Life Sciences and Facility Management– Institute for Chemistry and Biotechnology, Wädenswil, Switzerland, Bilateral JRP PhytoBalk, co-financed by the Ministry of Education and Science, Bulgaria and Swiss National Scientific Fund (д-р Евелин Волфрам и сътрудници); National Research Center of Cairo, Egypt, Marie Curie PEOPLE EMAP FP7 project and the Bilateral Exchange projects between the Egypt Academy of Sciences and Technology and the Bulgarian Academy of Sciences (проф. д-р Сабер Хендауи и сътрудници); Center of Biotechnology, BorjCedria, Tunisia, Marie Curie PEOPLE EMAP FP7 project (проф д-р Моез Жебара и сътрудници).

В момента се поддържа ин витро колекция от редица лечебни и етерично маслени растителни видове, характерни за балканската флора –SideritisscardicaGriseb. (Мурсалски чай), Pulsatillamontanassp. balcana (Velen.) Zämelis&Paegle(Планинско котенце, съсънка), P. hallerissp. rhodopaeaStoj. etStef. (Халерово котенце), HypericumrumeliacumBoiss. (Румелийска звъника), H.richeriVill. (Рихерова звъника), H. perforatumL. (Жълт кантарион), H. tetrapterumFries. (Четириръбеста звъника), H. calycinumL. (Чашковидна звъника), ClinopodiumvulgareL. (Котешка стъпка), InulabritannicaL. (Британски оман), ArtemisiaalbaTurra (Бял пелин). Отглеждат се и видове от Средиземноморската флора, например CapparisspinosaL. (Каперси) и др.

Следят се параметрите на растежа, физиологичния статус на живото растение ин витро (молекулярни маркери на оксидативен стрес, електрофоретично и спектрофотометрично охарактеризиране на ензимната активност, охарактеризиране на структурата и функцията на фотосинтетичния апарат). Получените данни се обработват с цел извеждане на закономерностите по стимулиране на биосинтеза на биологично активни вещества при изследваните видове.

Установени са хранителни среди за стимулиране на натрупването на биомаса, както и на биосинтеза на вторични метаболити ин витро при изследваните видове.

Вземете (Доживотен) абонамент и Подарете един на училище по избор!