Прекрасният нов свят на генното инженерство: CRISPR/Cas9

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
Share on email

Автор: Марина Красимирова Димитрова
II курс Медицина, Софийски университет „Св. Климент Охридски“

Досегът с книга като „Прекрасният нов свят“ на Олдъс Хъксли едва ли оставя повечето читатели безразлични. Много е изписано за обрисуваната в нея антиутопия, която по всички показатели следва да е идеален свят – тук няма болести, няма опасности, няма престъпност и всички са винаги щастливи. Цената на този перфектен свят обаче е индивидуалността – хората по-скоро се „произвеждат“, отколкото раждат. Най-ясният ми спомен от цялата книга все още е самото ѝ начало – разходка из Главния лондонски център за инкубация и обучение, където в епруветки се създават хора за различни професии. Чрез поредица от процедури всяка зигота накрая дава множество близнаци, абсолютно еднакви помежду си, в чиято ДНК е заложена цялата им обществена роля.

Нерядко подобни страховити истории от научната фантастика са основа за спекулации от страна на скептичните към възхода на науката, особено що се касаедо генното инженерство. Да отхвърлим напълно подобни притеснения,би било също толкова несериозно, колкото да им позволим да спрат всякакво развитие в тази насока. Напредъкът от последните години със сигурност заслужава внимание, особено с оглед на един конкретен инструмент, наречен CRISPR/Cas9. За да обясним тази заплашителна поредица от букви и цифри, нека започнем от най-основните неща, а в края на статията се надявам, че ще сте се убедили в красотата и елегантността на метода зад съкращението. Няма да пропуснем и да обърнем внимание на етичните съображения и предпоставки, като се надявам, че по-доброто разбиране на проблематиката ще ни даде и по-добра позиция при тяхното обсъждане.

ДНК е всъщност книга с инструкции за белтъците на клетката – как и кога трябва да бъдат синтезирани те. Тези инструкции обаче са записани чрез нуклеотиди с четири различни азотни бази – аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц).


РЕКЛАМА:

***

Най-грубо казано –това са буквите, чрез които в ДНК се формират думи и изречения.

Изреченията в ДНК могат да имат същите интересни свойства като тези в човешкия език, например да бъдат палиндроми – да се четат еднакво и в двете посоки (вероятно познат пример за това е „Дебел лебед“, но интернет има интересни предложения като „И дорест сив гнил лингвист се роди“ и „Аз обичам мач и боза“). Знае се също, че голяма част от секвенциите („думите“) в ДНК се повтарят – всъщност се предполага, че повече от 2/3 от цялата човешка ДНК се състои от такива повторения[1]. Ученитеса открили, че палиндромните повторения в конкретни части от ДНК на бактерии се разполагат на равни разстояния едни от други, прекъснати от различни уникални секвенции, наречени спейсъри (Фиг. 1). Този феномен бил наречен „струпани равномерно разпределени къси палиндромни повторения“, на английски “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”. За краткост се използва абревиатурата CRISPR, но дългото название върши чудесна работа, ако искате да смаете някого със знания по молекулярна биология. Дълго време след откриването им обаче те остават с неизвестна функция. Минават около 15 години, преди през 2005 г. нова светлина да внесат разработки, според които в спейсърите се включват части от ДНК от бактериални вируси[2]. Следователно чрез CRISPRбактериите записват и запомнят патогени, с които са се срещали в миналото, за да могат да реагират по-ефективно, ако се срещнат с тях в бъдеще. Така се налага концепцията за CRISPRкато своеобразна библиотека на имунната система на бактериите.

Библиотеката, разбира се, остава абсолютно неупотребяема, ако няма някой, който да знае как да я използва. Тази функция изпълняват CRISPR-асоциираните системи: Cas. Те са последователности, кодиращи белтъци, които оперират с CRISPRгените. Белтъците, синтезирани от тях, имат различна активност – някои могат да режат напречно ДНК, други да разделят двойната спирала. Регулацията на тази система се извършва от други ДНК последователности, наречени „лидерни“, които, за жалост, все още са слабо проучени. Всичко казано дотук е изобразено простичко на Фиг. 2, макар реално подредбата на гените да не е толкова строга –Casгените могат да бъдат както преди, така и след CRISPRсеквенциите.

Библиотеката също така може да бъде допълвана. Определени Casкомплекси могат да „взимат“ ДНК от навлезли в бактерията вируси и да ги превръщат в спейсъри. Така организмът разполага с непрекъснато нарастващ обем от информация, която да бъде използвана за защита на клетката.

Особено специален е Cas9, първоначално открит в ДНК от бактерията Streptococcus pyogenes. Той съдържа в себе си РНК, преписана от спейсърите, която се свързва специфично с комплементарна на нея ДНК. Cas9съдържа в себе си и белтъци, които могат да режат ДНК. Тези факти предполагат логичния механизъм на действие на системата – при първа инфекция с даден вирус Cas1белтък превръща чуждата ДНК в спейсър и я включва в CRISPRкомплекс от ДНК на бактерията. Когато вирус от същия вид отново инфектира клетката, се използва Cas9, който веднага го разпознава и срязва генетичната му информация така, че да му попречи да прояви вредното си въздействие.

След като механизмът вече е общо взето изяснен, идва следващият важен въпрос: как можем ние, хората, да използваме това знание в практиката?

Jennifer Doudna и Emanuelle Charpentier са учените, първоначално изследвали CRISPR/Cas9системата на споменатата бактерия[3]. Те откриват, че всъщност в състава на Cas9влизат два вида РНК – CRISPRРНК, която е преписана от спейсъра и съответно е комплементарна на вирусната ДНК, и трансактивираща CRISPRРНК, която спомага свързването с белтъчната част на комплекса (Фиг. 3). Екипът успява да слее тези две вериги в една цяла единична водеща РНК (guide RNA – gRNA). Това прави целия комплекс много по-удобен за работа в лаборатория – вече в състава му има само една РНК и белтъчна компонента, които много по-лесно могат да се разпознаят и самосглобят. Доказана е и на практика възможността за вмъкване на предварително синтезирана РНК с желаната последователност така, че цялата система да бъде строго специфична за определена част от ДНК. Тази публикация от 2012г. e смятана за повратна точка в цялото развитие на модерната биология.

Как на практика е използвана технологията? Предприети са няколко различни подхода към приложението ѝ. Първият и може би най-интуитивен начин е да се използва високата специфичност на свързване на Cas9с ДНК, за да се премахнат гени от вируси в клетките. За целта се използва комплекс, в който РНК е изкуствено синтезирана така, че да е комплементарна (съответна – бел.ред.) на последователността на определен вирус, да се свърже с него и да го инактивира. Това е постигнато за вируса на хепатит В, като след проведена терапия с CRISPR/Cas9значително намаляват различните молекулярни прояви на инфекцията в лабораторни мишки[4].

Друг хитър метод използва модифициран Cas9. Чрез промяна на една аминокиселина в белтъчните компоненти на комплекса учените „изключват“ способността му да реже ДНК. Полученият по този начин комплекс се нарича мъртъв (dead), понеже не проявява обичайната си активност, откъдето идва и съкращението dCas9. Той може само да се свърже с точно определена ДНК секвенция, което да попречи на свързването на други белтъци, които да оперират с нея – да я разчитат и превръщат в протеини, които от своя страна да проявяват своя активност. Така се получава заглушаване на определени гени (Фиг. 4, в средата). Проведени са успешни експерименти както върху моделни организми (E. coli), така и върху човешки клетки. Има доказателства и за възможно използване на dCas9за активиране на определени гени в прокариоти (Фиг.4, горе). Забелязано е също така, че оставянето на малки полета на несъответствие в комплементарната РНК води до по-малка репресия на гените. Това предполага, че чрез достатъчно проучвания е възможна много фина настройка на степента на експресия на различните части от генома.

Високата специфичност на свързване на Cas9със секвенции от генома има и приложение в локализацията на определени последователности. Ако към мъртвия комплекс бъде добавен флуоресцентен протеин, след свързването той може да бъде визуализиран чрез определена апаратура. Най-долу (Фиг. 4) е представен реален такъв експеримент, използван за доказване на повтарящи се секвенции в определен геном (GFP – green fluorescent protein, зелен флуоресцентен протеин). Този подход би могъл да има приложение в диагностиката.

За използването на CRISPR/Cas9-системата за директно срязване на клетъчната ДНК   и/ или нанасяне на корекции в нея трябва да се имат предвид наличните системи за възстановяване на увредени по този начин секвенции. През целия си живот клетката може да срещне хиляди различни фактори, които да увредят нейния геном. Това,разбира се, не трябва да се допуска, затова съществуват различни системи, които да поправят грешки – да извършват т. нар. репарация.

Дивият, немодифициран тип Cas9реже двете вериги от двойната спирала на ДНК. Определени ензими противодействат на това, като добавят или премахват нуклеотиди на празното място и възстановяват целостта. Процесът се нарича нехомоложно свързване на краищата(non-homologous end joining, NHEJ). Така обаче е много вероятно да се добавят грешни нуклеотиди и да се получат мутации и смущения в целия геном (подобна модификация е широко застъпена в туморни клетки).

По-предпочитаният за нас път на възстановяване е хомоложната репарация(homology directed repair, HDR). Ако в клетката е въведена ДНК, която в едната си част съдържа същата последователност като на срязаната верига, то определени ензими ще я използват и ще „внедрят“ на изрязаното място останалата част от въведената ДНК. Така в генома може да бъде включена съвсем нова последователност, предварително подбрана с определена цел.

За да избегнат каквато и да е проява на нехомоложна репарация, Le Cong и екипът му модифицират Cas9така, че да срязва само едната от веригите на ДНК. Така се избягва активността на ензимите от NHEJпътя и по-предпочитано е вече описаното хомоложно възстановяване. Схематично и двата вида репарация са представени на Фиг. 5.

Ефикасността на всеки инструмент за редакция на ДНК се измерва в процент постигнати желани мутации, или с други думи – колко от добавените ДНК вериги са се включили в генома на клетката. Докато при други подходи тя варира между 1% и 50%, за CRISPR/Cas9при някои видове е 70%, а според нови статии може да достигне и 78%. Това определя и факта, че тази система да е толкова широко разпространена в лабораториите по света, макар и сравнително нова.

Успоредно с проучването на Cas9е открит и проучен друг интересен комплекс с подобни функции в друга бактерия. Това е системата CRISPR/Cpf1на Francisella novicida. Той се отличава с две предимства: дивата му форма съдържа само една РНК, а срязаната от него ДНК не е с равни краища. Това я прави по-реактивоспособна и податлива на модификации. Cpf1-системата също има своето важно място в подходите за генетично инженерство, но разпространението ѝ все още е доста по-ограничено от това на Cas9.

CRISPR/Cas9е надежден, прост и универсален инструмент за генетично инженерство, което го прави все по-предпочитан за работа. Възможността да бъдат свободно добавяни и премахвани гени в клетките, определено дава основания да помечтаем за бъдещото приложение на метода. Въпреки това не бива да забравяме, че той все още не е достатъчно добре разбран и различни авторитетни научни колективи като например биолозите от списание Scienceна този етап застават против директното му приложение в клиниката[5].

Регулацията на използването на CRISPR/Cas9варира в различните страни. В САЩ процедурата е доста тромава и подлежи на все по-нови изменения от US Food and Drug Administration. Във Великобритания е регламентирано използването върху ембриони, но е строго забранено имплантирането им и те подлежат на унищожение в рамките на седем дни. Най-либерална е регулацията в Китай, където се провеждат и множеството подобни експерименти. Именно там през 2015 г. са правени опити за премахването на дефектни гени в зиготи, причиняващи наследственото заболяване Бета таласемия[6]. Премахнати са само част от проблемните участъци и са получени множество нежелани ефекти. Няколко фирми в Европа и Америка са подали документи в различни институции за започване на проекти за изследване на CRISPR/Cas9за лечение на Бета таласемия през 2018 г.

Очевидно сме много далеч от антиутопичното бъдеще на „дизайнерските бебета“, но воденето на умерена и внимателна дискусия по всички тези въпроси е най-добрият инструмент да избягаме от подобна плашеща прогноза. Науката сама по себе си не е добра или лоша, такива могат да бъдат само приложенията ѝ от самозабравилото се човечество, затова установяването на единни регулации на употребата на CRISPR/Cas9е важен международен проблем, който не бива да бъде игнориран. В противен случай, по думите на самия Хъксли, можем да се окажем „изненадани от собствената си напредваща технология“.

[1]DE Koning, AP Jason, et al. „Repetitive elements may comprise over two-thirds of the human genome.“ PLoS Genet 7.12 (2011): e1002384.

[2]Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (March 2005). „CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies“. Microbiology. 151 (Pt 3): 653–63.

[3]Doudna JA, Charpentier E. “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”. Science. 2012 Aug 17

[4]Ramanan V, Shlomal A. “CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus”. Nature. 02-05-2015

[5]Wade N (19 March 2015). „Scientists Seek Ban on Method of Editing the Human Genome“. The New York Times.

[6]Liang P, Xu Y et al. (May 2015). „CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes“. Protein & Cell.

 

 

Статия е публикувана в брой 110 на сп. Българска наука: тук!

Може да се абонирайте се за списанието тук!