CRISPR/Cas9 – революция в редактирането на гени

Николай Адамов – Факултет по химия и фармация, Софийски университет, София, България

Теодора Данева – Институт по Биология и Имунология на Размножаването – БАН, София, България

 

Резюме

Технологията CRISPR/Cas9 е фундаментално и много важно откритие за съвременната биология, което ние разглеждаме просто като начин за редактиране на генома. Той се крие във факта, че огромен брой бактерии носят в генома си ефективна система на адаптационен имунитет срещу потенциална вирусна инвазия. Основата на тази система са специални геномни региони – къси палиндромни клъстерни повторения или CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).

В крайна сметка технологията CRISPR/Cas9 може да промени гледната точка на човечеството към много различни наследствени заболявания. Ако по-рано те са били или напълно нелечими, или са разрешавали палиативно симптоматично лечение, вече би било възможно да се лекуват чрез манипулиране на отделни гени, тоест да се елиминира самата причина за съответното заболяване. Едновременно с появата на технологията за редактиране на генома, се появява възможността за нейното „подобряване“ по различни начини. За сега доста прости (от гледна точка на механизма за наследяване) болести и не само мутантни гени могат да бъдат потенциално мишени за редактиране, но и много гени, свързани с повишен риск за човешкото здраве. Много допълнителна работа предстои да се извърши в областите манипулиране и заместване на нуклеотиди, преди да може да се реализира пълният терапевтичен потенциал на тези подходи. Също толкова важно е да се вземат предвид всички морални и етични въпроси, свързани с терапиите за редактиране на гени, преди да се приложи какъвто и да е практически подход.

 

Въведение

Разработени са различни технологии за манипулиране на ДНК, но доскоро те бяха скъпи, трудоемки и отнемаха много време. Откриването на клъстерираните равномерно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR), механизмът на базираната на CRISPR прокариотна адаптивна имунна система (свързана с CRISPR система, Cas) и превръщането й в мощен инструмент за редактиране на ДНК промени напълно науката за манипулацията на гените. Редактирането на генома с CRISPR/Cas9 произлиза от естествения защитен механизъм, използван от бактериите,  да се предпазат от инфекция от бактериофаги и подвижни генетични елементи. В природата CRISPR функционира като бактериална адаптивна имунна система, произвеждайки РНК-и комлементарни на чуждите вирусни ДНКи, маркирайки ги за унищожаване. След първоначалния интензивен период на натрупване на данни, CRISPR скоро беше адаптирана за широк спектър от приложения – създавайки сложни животински модели на наследствени заболявания при човека и ракови заболявания; извършване на обследване на целия геном в човешки клетки за определяне на гените, отговарящи на специфични биологични процеси; регулиране на експресията на специфични гени; използвани за генетично модифициране на растения. Тази технология отвори безброй възможности за лесно, евтино и бързо редактиране на човешки гени. Тя буквално има потенциала да промени човешката медицина и здраве. Защо се случи тази внезапна революция и как работи тя?


РЕКЛАМА:

***

 

История и произход

От древни времена човечеството се опитва да управлява живота и хода на еволюцията чрез изкуствен подбор, селектиращ белезите от растения и животни, получени чрез случайни мутации, които са най-полезни и значими. Чрез селективно развъждане селектирахме полезните свойства на растенията и животните. Този процес обаче отнема много време. Ставаме много добри в това, но така и не разбирахме напълно как работи, докато не открихме ДНК. През 20-ти век е открита структурата на ДНК и са открити много възможности за изследване. През 70-те години се правят опити за ускоряване на тези мутации чрез третиране на растителни култури с различни мутагенни фактори като радиация или химикали и скрининг на полезните. През 70-те години учените вмъкват ДНК фрагменти в бактерии, растения и животни, за да ги модифицират за изследвания, медицина, селско стопанство и дори за забавление. Това поставя началото на генното инженерство. Днес ние произвеждаме много вещества чрез генното инженерство като животоспасяващи фактори на съсирването, хормони като инсулин и хормон на растежа, растежни фактори и други. Всички неща, които трябваше да се извличат от органите на животните преди това, сега се произвеждат чрез генно инженерни методи.

 

По време на своята еволюция бактериите са разработили набор от механизми, за да се предпазят от нашественици като фаги и плазмидни нуклеинови киселини. Съществуват различни прокариотни защитни системи и поне две от тях са насочени директно към инвазивната ДНК: Рестрикционна Модификация (RM) и CRISPR-Cas система. И двете системи са съвместими и действат заедно за повишаване на бактериалната устойчивост към фаги чрез нарязване на съответните им целеви места и за намаляване на заразяванията с фаги.

Идентифицирана е специфична последователност от повтарящи се гени в E. Coli, показваща пет силно хомоложни последователности от 29 нуклеотида, подредени като директни повторения с 32 нуклеотида като интервал [1].

Haloferax Mediterranei е архебактериален организъм с изключителна толерантност към солта и високата концентрация на сол влияе върху начина, по който рестрикционните ензими режат генома на микроба. В изследваните фрагменти на ДНК са открити множество копия на почти перфектна, грубо палиндромна, повтаряща се последователност от 30 базии, разделени с дистанционни елементи от приблизително 36 бази – които не приличат на нито едно семейство повторения, познати в микробите [2].

Името CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats е предложено от Jansen, et al. [3]. През 2005 г. е установено, че повторенията в последователността са геноми от бактериофаги или друг екстрахромозомен произход [4]. През 2007 г. е съобщено, че CRISPR осигурява резистентност срещу вируси в прокариотите [5,6].

Системата CRISPR-Cas е бактериална „имунна система“ срещу бактериофаги. Това е последователност на бактериалния геном, която се състои от повтарящи се къси палиндромни ДНК области с дължина 30-40 нуклеотидни двойки. Те са разделени от участъци от ДНК, наречени „дистанционни елементи“. Тези региони са различни и е установено, че съвпадат идеално с ДНК на бактериофагите, с която бактерията вече се е сблъсквала. С CRISPR последователността са свързани региони на ДНК -Cas гените (CRISPR асоциирани последователности), които кодират CAS информация за протеини. Те са главно хеликази и нуклеази. Поради това CRISPR се нарича „имунна система на бактериите“ [7,8]. През 2009 г. Hale, et al. публикува доказателства, че системата CRISPR-Cas защитава прокариотите от вируси и други потенциални нашественици на геноми чрез уникална система за заглушаване на РНК, която функционира чрез хомоложно зависимо разцепване на нашественици РНК [9]. През 2010 г. Maraffini и Sontheimer са дефинирали механизма на CRISPR саморазпознаване / не-саморазпознаване чрез малки CRISPR РНКи (crRNAs) [10-12]. „Имунната система“ на CRISPR/Cas е изключително адаптирана да разцепва бързо нахлуващата ДНК и има потенциала да генерира по-защитени микробни щамове [13].

 

Как работи CRISPR

Когато бактериофагът зарази бактериите и инжектира вирусната ДНК в бактериалната клетка, вирусният геном ще принуди клетката да произвежда вирусните протеини и вирусните ензими и след това ще промени цялата клетъчна техника на бактерията. Благодарение на системата CRISPR бактериалната клетка може да предотврати това да се случи втори път. Това е един вид памет за предотвратяване същият бактериофаг да зарази клетката друг път. Системата CRISPR е тристепенен механизъм. Първият е Spacer Acquisition, вторият е обработка на crRNA, а третият е интерференция и деградация на целта. Има три типа CRISPR: тип I, тип II и тип III в зависимост от бактериалната клетка. Когато бактериофагът заразява за първи път бактериална клетка, бактериалната клетка нарязва генома на вируса и взема парче от него и го вмъква в спейсърната ДНК в бактериалния геном. Всеки път, когато вирусът заразява бактериалната клетка, клетката взема част от неговата ДНК и я вкарва в дистанционната ДНК. Ензимите Cas са семейство ензими, които участват в процеса CRISPR. Повечето от Cas ензимите са нуклеази или хеликази. В Spacer Acquisition има двама основни играчи – Cas1 и Cas2. И двата са димери, които образуват комплекс заедно, за да формират Spacer Acquisition. Cas1 може да има нуклеазна и интегразна активност. Те могат да изрежат вирусния геном и да го интегрират в ДНК. Cas2 са ендорибонуклеази и могат главно да режат РНК (някои бактериофаги имат РНК геном).

Има три различни вида обработка на crRNA. При I тип CRISPR повтаря цикли на формата и след това иРНК на messenger ще бъде отрязана от Cas6e или Cas6f. ИРНК ще се нарязва на малки парченца РНК и всяка част съдържа контур и парчето от вирусния геном. Тези малки парченца са crRNA. При обработка от тип II има друг играч, наречен tracrRNA (транс активираща crispr РНК). Това са РНК парчета, които се свързват с crRNA на иРНК. Тогава тРНК ще бъде нарязана от Cas9 и RNase III на парчета, състоящи се от парче вирусен геном, crRNA и trRNA. При тип III Cas6 хомологът ще нарязва иРНК директно върху парче вирусен геном и crRNA.

Цялата статия, както и много други, можете да прочетете в новият Брой 137 на списанието>>  

Издаваме вече 15 г. онлайн списание, което цели да покаже красотата на знанието. Стремим се с всеки брой да покажем най-новото в науката и да имаме нови български учени-автори, които да ви покажат своята работа чрез достъпно написани статии. В този брой има около 8 авторски статии, които са актуални, интересни и вярвам ще останат дълго в съзнанието ви, а някои от вас дори ще разказват прочетеното.

Важно е да отбележа, че от този брой абонамента става 49 лв. за година и 4,50 лв. за периодично плащане месец за месец. Също така вече може да четете списанието в е-четец – формати ePub и mobi, като запазваме PDF-a и дори в момента работим да бъде още по-добре изглеждащ. Може да видите демо на този брой по-долу.

Вижте този и всички предишни броеве, важно е да се знае!


Европейска нощ на учените 2022 г.: